饲料中植物凝集素（lectin）的快速检测方法——血凝法
饲料中植物凝集素（lectin）的快速检测方法——血凝法
植 物凝集素（Lectin）是广泛存在于各种植物性饲料及其原料中的抗营养因子，采食过量时动物表现为日增重减少，饲料利用率下降，并影响免疫系统功能。由 于植物凝集素具有凝集动物红细胞的能力，且凝集活力（效价）与Lectin的量成线性关系（张维杰，1994），因此可以利用凝血反应测定血凝活力，然后 利用标准品与待测样品的血凝活力比较对Lectin进行定量检测。本试验以大豆凝集素（SBA）为研究对象，建立了实验室快速检测SBA的方法一血凝法。1 材料和方法 字串2
1.1红细胞悬液的制备
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本试验选用兔红细胞作为检测指示物。心脏采血后，注入装有玻璃珠的椎形瓶中摇动，以脱去纤维。取脱纤维血液 2.5mL加入 50mL pH7.2的血球缓冲液(PSB)(0.02mol／L 磷酸缓冲液，O.1mol/L NaCL)将红细胞配成5％(V／V)悬液，再加入含4％戍二醛的等体积PBS，立即混匀，再加入叠氮钠0.2％（W／V）。室温（20－ 25℃）下静置10小时，其间每隔2小时搅拌一次。然后用相同的PBS洗涤数次，除去未作用的戍二醛，用1O0mL相同的PBS配成2.5％的红细胞悬液 （每 µL红细胞悬液中红细胞数目约为 1.6×105个），4℃：保存备用，可保存 3－ 6个月。
1.2凝集素的提取 字串7
取适量待测饲料样品，用微型植物材料粉碎机粉碎过80日筛，然后准确称取1g粉碎样品用30－60℃沸腾的石油醚8mL抽提10小时，其间每隔2小时搅拌一次。过滤后滤渣以8mL。生理盐水抽提10小时，离心(3000rpm，10min)后取上清液进行检测。 字串6
1.3 凝集素的检测 字串5
在72 孔“V”型血凝板中每孔加入15μL pH7.2的血球缓冲液。取凝集素标准样品15μl，加入第一孔，混匀后取出15μL，加入第二孔，混匀后亦取出15μL，加入第三孔。以此类推，作倍比 稀释。待测样品也按上述步骤操作。然后每孔加入15μL 2.5％血球悬液，在室温（20－25℃）置放1.5－2小时。
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2 结果判定与含量计算
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无 凝集时血球沉于“V”型孔底部，呈一小圆点；凝集时血球相互集聚形成一片网络，不下沉。不同程度的凝集孔，其凝集强度用数字表示：红细胞形成薄层凝集，均 匀分布整个孔底（强凝集时边缘可出现维缩），判为全凝集，记“4’；孔内凝集范围比半凝集大，未遍及全孔者，判为多半凝集，记为“3’；红细胞少许沉积中 部，周围有混浊带，约占孔面积的50％，外围液澄明者，判为半凝集，记为“2”；红细胞大部分沉积于孔中心，沉积点边缘模糊者，判为少许凝集，记为 “1”。凝集效价的计算以“2”为终点。被测样品中Lextin的百分含量C.计算公式如下：
C＝ SO × f× V ÷W× 100％ 字串8
式中S0为标准样品的浓度（µg／mL），f为待测样品的凝集效价，V为待测样品溶液的体积（mL），fo为标准样品的凝集效价，W为待测样品质量（收入按本法检测饲料原料及成品26例，最低检出浓度为8mg／kg。标准品的平均回收率为97.3％。3 讨 论 字串9
血凝法检测植物凝集特别适用于血凝活性较高的凝集素如 SBA，具有“灵敏度高，操作简便，费时少的优点。能够在短时间内进行大量样品的检测。 字串9
红细胞悬液也可取新鲜兔脱纤维血液2.5mL用生理盐水离心洗涤数次后将洗涤好的血球沉淀用100mL生理盐水稀释配成，该处理可简化操作步骤，但这样配制的红细胞悬液只能现配现用，不能长期保存。
该法不只适用于大豆凝集素的检测，对于其它植物凝集素也普遍适用。检测凝集活性不高的凝集素时，可先将兔红细胞用胰蛋白酶在37℃下处理1小时或用戌二醛在室温下处理凝集3小时，这样处理后能大大提高凝集素的凝集效价。
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